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    幽門螺桿菌是慢性胃炎、消化性潰瘍及胃腸道淋巴瘤的主要致病因素，并與胃癌發(fā)生密切相關，WHO將其列為第一級致癌物質(zhì)，流行病學調(diào)查表明，我國是胃癌癌的高發(fā)區(qū)及幽門螺桿菌高感染區(qū)，已對人民健康造成重大危害，盡管抗生素治療在幽門螺桿菌相關性治療方面取得了較大進展。但其毒副作用明顯，療效不穩(wěn)定，無法解決其復發(fā)問題，人類與病原微生物的長期斗爭歷史表明，醫(yī)學教育——網(wǎng)搜集整理有效控制和徹底消滅某種傳染病的最佳途徑是疫苗接種，幽門螺桿菌疫苗接種將是預防幽門螺桿菌感染，降低幽門螺桿菌相關性疾病發(fā)病率的最佳選擇。

    1995年費城會議上Rapuoli指出開發(fā)幽門螺桿菌疫苗需要至關重要的三種成分：①必須現(xiàn)能干擾粘附和毒性且存在于所有菌株的保護性抗原。如尿素酶、熱休克蛋白60、粘附素等；②臨床前試驗需要能模擬感染和疾病的動物模型，一種新的幽門螺桿菌感染小鼠需要新鮮的臨床分離株來感染小鼠，這一模型能重復人體疾病的諸多臨床表現(xiàn)，如上皮細胞損害和炎癥等；③需要有適用人體的粘膜佐劑，比較肯定的有霍亂毒素B亞單位、大腸桿菌熱敏毒素B亞單位等。

    1.抗原基因的選擇研究疫苗的首要任務

    便是尋找免疫原，Lazowskaetal在幽門螺桿菌蛋白免疫原的尋找方面作了較為出色的工作，最初應用全菌抗原和膜佐劑口服免疫幽門螺桿菌感染的小鼠，成功誘導小鼠保護性免疫反應，醫(yī)學教育——網(wǎng)搜集整理但全菌抗原成分復雜，副反應多，研制幽門螺桿菌亞單位疫苗成為必然。幽門螺桿菌Ure基因組，由A,B,C,D四個亞基基因組成，基因結(jié)構(gòu)已清楚，其中A,C,D亞基免疫原性差，其免疫保護作用十分微弱，僅有UreB亞基能產(chǎn)生保護性免疫，是疫苗和診斷用抗原的主要候選基因之一；CagA基因較大，編碼分子量94KD的細胞毒性相關蛋白，是幽門螺桿菌的主要致病因子。因此研究UreB或CagA相關的疫苗將能有效預防致病幽門螺桿菌的感染和發(fā)病，Ure作為候選菌苗有許多優(yōu)點：

    在菌株中含量豐富，分布在細菌表面，廣泛表達和高度保守；其大分子量和顆粒狀結(jié)構(gòu)也更有利于粘膜免疫接種。Pappoetal用純化的HelicobacterfelisUreB亞單位和CT口服免疫小鼠后可抗Hf定植，而UreA亞單位則無保護作用，UreB亞互單位和LT口服免疫小鼠，同樣產(chǎn)生抗Hf感染保護力，重組的Ure和LT口服、鼻腔、直腸免疫同樣能夠誘導小鼠產(chǎn)生免疫保護力，Ure抗體被動免疫小鼠后也能預防Hf感染的事實，間接說明Ure誘導產(chǎn)生的免疫保護力是體液免疫應答介導的，螺桿菌屬的Ure同源性非常高，幽門螺桿菌UreB亞單位和佐劑CT口服免疫小鼠可抗Hf感染的事實，說明螺桿菌屬的Ure存在交叉性表位，免疫后可引起交叉性保護，目前在小鼠模型上已證實多種幽門螺桿菌抗原包括VacA,Ure,CagA,過氧化氫酶、幽門螺桿菌GroES類蛋白等。都可誘導小鼠產(chǎn)生免疫保護力。

    疫苗能否清除已有的感染？Doidge采用幽門螺桿菌超聲裂解物和重組UreB亞單位，結(jié)合CT口服免疫慢性幽門螺桿菌感染小鼠，結(jié)果證實口服免疫兼具預防和治療雙重作用，Doidge在Hm感染的雪貂中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。Ghiaraetal研究了幽門螺桿菌相關抗原作為疫苗治療慢性幽門螺桿菌感染效果，同時也試驗大腸桿菌突變脫毒腸毒素作為粘膜佐劑的可能性，結(jié)果表明不管是幽門螺桿菌超聲裂解物或者重組蛋白VacA和CagA,與UTK63一起免疫，都成功地清除了小鼠體內(nèi)已有的幽門螺桿菌，并且免疫3mo后仍無感染，Marchettietal實驗了LT,LTK63佐劑與全菌、內(nèi)源性VacA,Ure,CagA及重組VacA,CagA的免疫保護作用，發(fā)現(xiàn)都可激發(fā)小鼠產(chǎn)生免疫保護。

    2.關于佐劑粘膜免疫

    需要強的佐劑以提高抗原的免疫原性，粘膜佐劑可**Th2型粘膜免疫反應。未來的幽門螺桿菌疫苗必須輔以能有效誘導粘膜免疫的佐劑，活化Th2細胞免疫途徑，才能產(chǎn)生大量的slgA,才能克服幽門螺桿菌抗原性弱的問題。CT和LT是目前研究最為深入的粘膜免疫佐劑，它們都具有較強的粘膜免疫原性和粘膜佐劑效應， 與不相關可溶性蛋白抗原同時口服免疫機體，能消除機體對這些免疫蛋白的耐受性，誘導機體產(chǎn)生針對CT及其免疫蛋白的長期免疫記憶。

    它們都能促進抗原遞呈細胞的抗原呈遞，選擇性誘導抗原特異性Th2細胞應答，促進上皮內(nèi)淋巴細胞的有絲分裂和B細胞種型分化，但由于CT口服時在某些品系小鼠誘生超敏反應，而改用CT-B單位即可避免，故有人認為CT-B是至今為止最為有效最為安全的粘膜免疫佐劑之一，目前人們更為青睞LT-B,因為LT-B較CT-B擁有更可靠的安全性和有效性，Michertietal在臨床實驗了重組幽門螺桿菌Ure和LT口服免疫幽門螺桿菌染的志愿者的安全性和免疫原性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療患者僅出現(xiàn)腹瀉等，較少的副反應；而使用脫毒LT可避免以上副反應。LTK63與LT區(qū)別在于絲氨酸取代了第63位的賴氨酸，LTK63作為粘膜佐劑在動物模型上已成功誘導抗原特異的體液免疫反應和風疹病毒特異的毒性淋巴細胞反應，因此LTK63作為佐劑完全可能在未來臨床中用于幽門螺桿菌治療性免疫。最近Kinetal采用聚微囊包襄的全菌抗原口服免疫小鼠同樣可誘導小鼠產(chǎn)生強烈的系統(tǒng)和粘膜免疫，免疫8wk后，胃腸液中抗幽門螺桿菌slgA和血清lgG仍維持較高平，幽門螺桿菌菌攻擊小鼠保護率高達95%,與CT,LT佐劑組對比無顯著差異，表明聚微襄顆?？梢哉T導針對幽門螺桿菌特異系統(tǒng)和粘膜免疫，并且可以作為未來幽門螺桿菌疫苗的佐劑。

    3.關于疫苗蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)及抗原表位預測

    抗體分子在抗原上的結(jié)合位點稱為抗原決定簇，又稱抗原表位。它是蛋白質(zhì)的表面性質(zhì)，常出現(xiàn)在分子的高暴露區(qū)域，其性質(zhì)、數(shù)目及空間的構(gòu)型決定其抗原特性，為精確描述抗原決定簇，可用同源蛋白質(zhì)來評價特定氨基酸替換的影響以確定抗原表位的所在區(qū)，不過這里的表位是指“功能表位”,即一種蛋白質(zhì)能在免疫檢測中結(jié)合抗體的那一部分或片段、因此研究某種蛋白質(zhì)有意義的亞單位結(jié)構(gòu)和功能，它在實驗使用上有實際意義。利用計算機軟件可以預測蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和抗原位點，這可作為抗原多肽合成試驗的選段參考，適當左右擴展成10——20肽，也可用作抗原克隆表達實驗前PCR引物設計時模板范圍選擇的參考，使擴增出的序列能夠覆蓋較多的預測點，這對我們研制幽門螺桿菌基因工程疫苗有重要指導意義。

    4.幽門螺桿菌疫菌的免疫保護機制

    免疫應答類型的確定直接決定人類疫苗學研究發(fā)展，幽門螺桿菌感染的免疫應答類型很難確定，這是因為自然感染幽門螺桿菌后，引起的免疫反應無保護性；而感染幽門螺桿菌的嚙齒類動物，采用經(jīng)典免疫學技術(shù)很難分析疫苗的治療性免疫應答機制。最近有報道在幽門螺桿菌感染者胃粘膜中slgA水平明顯高于對照組，提示粘膜slgA在抗幽門螺桿菌感染中具有重要作用，Doigeetal用Hf超聲裂解物免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)抗螺桿菌slgA水平與保護作用密切相關。T淋巴細胞在幽門螺桿菌感染中的保護作用目前知之甚少。幽門螺桿菌感染患者外周血單核細胞的**和抑制作用已有報道，幽門螺桿菌感染的小鼠和人類，THI細胞被抑制，小鼠的保護性免疫與THI細胞抑制和TH2細胞活化密切相關。

    目前幽門螺桿菌疫苗誘導機體產(chǎn)生保護性免疫和治療作用的機制仍不清楚，Ghiaraetal認為疫苗可能改變胃內(nèi)Thl型應答反應，轉(zhuǎn)變?yōu)門HO或Th2型保護性反應；并且在慢性幽門螺桿菌感染小鼠模型中出TH1細胞反應口服幽門螺桿菌菌苗誘導THO或Th2細胞活化反應，清除體內(nèi)感染的細菌，幽門螺桿菌感染的小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)Th2反應**程度與胃粘膜內(nèi)細菌減少和胃炎消退密切相關，幽門螺桿菌免疫小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)IFN-γ下清Thl反應，胃內(nèi)Th2細胞分泌IL-4水平增高；體外培養(yǎng)幽門螺桿菌免疫小鼠后，發(fā)現(xiàn)大量脾細胞中有幽門螺桿菌特異Th2細胞，脾細胞接種其他動物發(fā)現(xiàn)明顯減少胃內(nèi)幽門螺桿菌感染量。Mohammadietal也發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果，并證明IL-4基因敲除小鼠體內(nèi)幽門螺桿菌感染數(shù)量明顯高于對照組，目前研究表明幽門螺桿菌慢性感染人群Thl細胞反應占主要地位，人類胃粘膜反應是否與小鼠相同？如果類似，采用無毒粘膜佐劑，治療性疫苗可能是清除幽門螺桿菌感染的新的方法。

    5.幽門螺桿菌感染的動物模型

    研制幽門螺桿菌疫苗的先決條件是必須建立合適、穩(wěn)定的幽門螺桿菌慢性感染動物模型，以分析免疫應答和免疫保護機制。在螺桿菌屬細菌中，Hf與幽門螺桿菌的生化特征和生物學行為最為接近，其16sDNA基因序列與幽門螺桿菌的同源性高達94.6%,Ure、過氧化物酶、過氧化氫酶均為陽性，生長條件相近，還具有相對較廣的宿主范圍，Hf在小鼠胃內(nèi)的定植無明顯部位特異性，與人幽門螺桿菌胃內(nèi)定植部位基本一致，并能引起與人類幽門螺桿菌相關胃炎相似的病理改變。王繼德博士etal研究證實無特殊病原菌級Balb/c小鼠對Hf易感，25只小鼠的感染成功率為100%,并能在胃內(nèi)長期存活達16wk以上，用ELISA法在感染16wk以后的小鼠血清、胃腸液中可檢出抗Hf-lgG抗體，并發(fā)現(xiàn)該抗體與幽門螺桿菌抗原有明顯的交叉反應，這證明兩種細菌有許多共同免疫原，幽門螺桿菌定植成功的有悉生豬、狗和無胸腺小鼠。但這些動物昂貴，需特殊飼養(yǎng)條件，且允許觀察時間不足1mo,國內(nèi)學者陳晶晶1990年最道了幽門螺桿菌的wistar大鼠模型的成功**，但不足之處在于幽門螺桿菌定植時間不超過1mo.有報道用靈長類動物**幽門螺桿菌模型，由于靈長類動物胃內(nèi)生理結(jié)構(gòu)與人類高度相似，可望獲得長期感染，但該純系動物不易獲得，飼養(yǎng)困難，價格昂貴。另外由于幽門螺桿菌的動物宿主譜較窄，其動物感染模型尤其是常規(guī)小動物長期感染模型的建立，向未兄有成功的報道。故人們在研究中廣泛應幽門螺桿菌的近緣菌感染小動物模型，Hf小鼠模型是最常用的一種。

    6.幽門螺桿菌減毒沙門疫苗

    沙門菌是寄生于人和動物腸道的革蘭陰性菌，它可以作為其他病毒、細菌、寄生蟲等病原體的蛋白、抗原或表位的表達載體，向機體輸送單價或多價抗原，誘發(fā)系統(tǒng)免疫和粘膜免疫，沙門菌通過其自然感染方式經(jīng)過粘膜侵入呼吸道、消化道、雌性生殖道等粘膜淋巴組織，M細胞取和運輸抗原。觸發(fā)粘膜免疫反應，**slgA特異的B細胞向其他粘膜組織遷移并分化成漿細胞，分泌slgA釋放到粘膜表面，防止病原體再度感染。此外沙門菌也可隨血流分布到機體的肝、脾和淋巴結(jié)等處，寄居在單核巨噬細胞中，激發(fā)機體的免疫應答，減毒沙門活菌疫苗表達的外源蛋白，無論采用口服免疫、鼻腔免疫、直腸免疫或**免疫，都能誘導哺乳動物產(chǎn)生顯著而特異的免疫應答，包括全身和粘膜的體液免疫應答。目前沙門菌載體菌苗系統(tǒng)常見的突變株包括：Ty21a,aro,asd,cya,crp等突變株，其中aro基因突變株不僅高度減毒，而且具有良好的免疫原性，被廣泛用作表達多種異源抗原的載體，而cya,crp突變株不僅減毒具有免疫原性，而且是雙基因突變，回復突變的可能性極小，因此用該突變株作為載體菌苗很安全。目前減毒沙門菌疫苗研究多利用其天然宿主-小鼠來研究外源蛋白的免疫原性，人類應用減毒沙門菌疫苗也取得了令人鼓舞的成果，目前幽門螺桿菌減毒沙門菌苗載體多為沙門菌突變株，如aro、phoPc等。Gomez-Durateetal用表達幽門螺桿菌UreA,B亞單位的減毒沙門菌SL3261aro突變株，口服免疫Balb/c,C57/B6小鼠，然后用野生株攻擊，免疫組獲100%保護，對照組則無保護作用，血清、胃粘液中抗Ure抗體均升高，說明減毒沙門菌能表達強免疫原性UrE.Corthesyetal用表達Ure的phoPc突變株鼻腔免疫小鼠也獲得了滿意的保護率，能誘導體液吏疫和細胞免疫，并**T細胞增殖、分泌IFNγ，IL-2.IL-4,IL-5,IL-6等細胞因子，說明沙門菌表達的Ure特異誘導了Thl,Th2等淋巴細胞反應。但是幽門螺桿菌減毒活疫苗的研究尚有許多困難待克服：①宿主對幽門螺桿菌減毒沙門菌苗的免疫應答機制及幽門螺桿菌菌逃避甚至破壞機體的免疫應答機制尚不清楚；②需進一步提高減毒沙門活菌疫苗的安全性和免疫原性；③研制穩(wěn)定、高效表達幽門螺桿菌精制亞單位抗原的減毒沙門活菌疫苗。幽門螺桿菌感染與潰瘍和胃癌的相關性己廣為接受，耐藥苗株不斷增多以及發(fā)展中國家幽門螺桿菌感染率不斷增高的事實，使我們只有寄希望于疫苗來根治和預防幽門螺桿菌感染。國外幽門螺桿菌疫苗的研究已臨床前期試驗醫(yī)學教育——網(wǎng)搜集整理。

    因此我們研制價廉、高效，兼具預防和治療作用的疫苗已迫在眉睫。幽門螺桿菌菌體抗原成分復雜，含有多種外毒素致病因子，全菌粗制抗原易于引發(fā)不良反應，幽門螺桿菌又難以大規(guī)模生產(chǎn)性培養(yǎng)；另外幽門螺桿菌減毒活疫苗的研究有許多問題待解決，目前正重點進行組分疫苗及基因工程疫菌的研究，因此尋找和篩選的致病新基因是其疫苗研究工作的重點，由于任何一種幽門螺桿菌成分作抗原其免疫原性都較弱，因此聯(lián)合佐劑的亞單位疫苗能克服全菌疫苗的諸多不足；尤其是與佐劑一體化的亞單位基因工程疫苗的研究，是幽門螺桿菌疫苗研究的主攻方向之一。